闫雪孟，刘世勇，林诚诚，陈日丹，曹儒宾
（武汉康乐药业股份有限公司，湖北 武汉 430056）
白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根。夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干。具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的作用，用于治疗血虚萎黄、月经不调、自汗、盗汗、胁痛、腹痛、四肢挛痛以及头痛眩晕等［1］。化学成分研究表明，白芍主要含有单萜苷类、三萜类、黄酮类等化学成分。药理研究表明，白芍具有抗炎镇痛、护心、抗血栓、降糖、改善骨关节炎和保肝等广泛的药理作用［2-3］。
作为系统生物学的衍生学科，网络药理学因其与中医药理论共通的认知，被广泛应用于中药的理论研究［4-5］。中药质量标志物是存在于中药材和中药产品中与中药功能属性密切相关的化学物质，是能够反映中药是否安全有效的标识性物质［6-7］。本文基于网络药理学技术和高效液相探究白芍的作用机制，分析白芍的质量标志物，揭示白芍的药用物质基础，为白芍的理论研究提供更丰富翔实的资料。
1.1 主要仪器
高效液相色谱仪（Waters公司，型号：Waters e2695）；
高效液相色谱仪（Aglient公司，型号：Aglient 1260）；
电子天平（Mettler Toledo公司，型号：MS204S）；
电子天平（Mettler Toledo公司，型号：XP26）。
1.2 主要试剂及药物
没食子酸（中国食品药品检定研究院，批号：110831－201906）；
儿茶素（中国食品药品检定研究院，批号：110877－202005）；
芍药内酯苷（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：4644）；
芍药苷（中国食品药品检定研究院，批号：110736－201842）；
β－1，2，3，4，6－五没食子酰葡萄糖（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：3367）；
苯甲酸（中国食品药品检定研究院，批号：100419－201703）；
苯甲酰芍药苷（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：4633）；
原儿茶酸（中国食品药品检定研究院，批号：110809－201906）；
氧化芍药苷（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：0220）；
苯甲酰氧化芍药苷（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：0310）；
甲醇（Sigma，色谱纯）；
乙腈（Sigma，色谱纯）；
磷酸（国药集团化学试剂有限公司）；
乙醇（Sigma，色谱纯）。
白芍（批号分别为PZ19012505、PZ19022503、PZ19021101、PZ19021105、PZ19022505、PZ19022507、PZ19021203、PZ19012503、PZ19012501、PZ19031103、PZ19022501，产地：安徽省亳州市）；
白芍（批号分别为PZ19030501、PZ19030503、PZ19030507，产地：浙江省磬安县）；
白芍（PZ19021803、PZ19021801，产地：四川省德阳市）。经湖北中医药大学刘大会教授鉴定为毛莨科植物芍药（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根。
2.1 网络药理学研究
2.1.1 活性成分筛选与靶点预测
使用TCMSP数据库与分析平台，筛选白芍的活性成分及靶点；
设置口服生物利用度（oral bioactivity，OB） ≥ 30%，化合物类药性（drug－like，DL） ≥ 0.18，获取白芍的活性成分13个。见表1。利用UniProt数据库，限定物种为“Homo sapiens”，确定靶点的UniProt ID，共计71个。
表1 白芍活性成分
2.1.2 与白芍功能主治相关疾病靶点的筛选
通过GeneCards平台和OMIM平台，以anemia、menstruation、perspire during sleep、ache、hypochondriac pain、abdominal pain、Limb pain cramps、headache、dizziness、liver cirrhosis以及hepatitis为关键词搜索并汇总合并重复基因靶点，共计19 676个。其中与白芍的活性成分靶基因匹配的靶点共计146个。利用R语言，生成韦恩图。见图1。
图1 白芍－功能相关靶点韦恩图
2.1.3 蛋白质相互关系网络构建（PPI）与关键基因的筛选
将146个共有靶点输入STRING，限定物种为“Homo sapiens”，除去孤立的点，选取最高置信度蛋白交互参数评分值 ＞ 0.7的蛋白互作数据，获得蛋白相互作用关系。见图2。利用R语言，筛选连接节点最多的30个基因。见图3。
图2 PPI网络
图3 关键靶基因柱状图
PPI网络共包括134个节点，700条边。30个靶点按连接节点数从大到小依次为IL6（42）、MAPK1（42）、JUN（39）、EGF（34）、IL1β（34）、CXCL8（33）、MMP9（31）、CCL2（28）、MYC（27）、PTGS2（27）、ICAM1（26）、IL10（26）、FOS（25）、CASP3（23）、ESR1（22）、MMP2（22）、STAT1（21）、PPARG（20）、CXCL10（19）、HMOX1（19）、NOS3（19）、CRP（17）、IFNG（17）、IL2（17）、PRKCA（17）、PRKCB（17）、AR（16）、MMP1（16）、CXCL2（15）和ERBB2（15）。白芍可能主要通过影响免疫应答发挥功效，调控生理活动。
2.1.4 功能富集与通路富集分析
对146个基因进行基因本体GO功能富集分析，共获取377个GO条目，包括185个生物学过程条目，71个细胞成分条目和121个分子功能条目。根据校正P值大小，确定了10条分子功能相关条目（P≤ 2.59 × 10-7），包括酶结合、蛋白质结合、转录因子活性、血红素结合以及类固醇激素受体活性等；
确定了10条细胞成分相关条目（P≤ 1.87 × 10-6），包括细胞外间隙、质膜组成、细胞陷窝、染色质、膜筏以及核质等；
确定了10条生物学过程相关条目（P≤ 8.37 × 10-11），依次为DNA模板转录的正调控、对药物的反应、对脂多糖的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正调控、对雌二醇的反应、对缺氧的反应、细胞对镉离子的反应、对外来刺激的反应以及信号转导。见图4。对共有靶基因进行KEGG通路富集分析，得到149条通路，涉及癌症通路（pathways in cancer）、糖尿病并发症中的AGE－RAGE信号通路（AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、脂质与动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、乙肝（hepatitis B）、化学致癌－受体激活（chemical carcinogenesis－receptor activation）、膀胱癌（bladder cancer）、IL－17信号通路（IL－17 signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma－associated herpesvirus infection）、丙肝（hepatitis C）以及甲流（influenza A）等。见表2。
图4 GO生物过程富集图
表2 KEGG通路富集分析
2.1.5 “白芍－成分－靶点－功能”网络构建及分析
将146个共有靶基因导入Cytoscape 3.8软件，构建“白芍－成分－靶点－功能”调控网络。该网络由155个节点、228条边组成，其中红色节点代表白芍药材，蓝色节点代表白芍活性成分，黄色节点代表功能，绿色节点代表共有靶点。见图5。山柰酚（kaempferol）所间接的基因个数最多，有42个，其余按间接基因数排序依次是β－谷甾醇（beta－sitosterol）23个，儿茶素［（+）－catechin］7个，芍药苷（paeoniflorin）3个，谷甾醇（sitosterol）3个，芍药苷元（paeoniflorgenone）2个，（3S，5R，8R，9R，10S，14S）－3，17－二羟基－4，4，8，10，14－五甲基－2，3，5，6，7，9－六氢－1H－环戊烷［a］菲－15，16－二酮（（3S，5R，8R，9R，10S，14S）－3，17－dihydroxy－4，4，8，10，14－pentamethyl－2，3，5，6，7，9－hexahydro－1Hcyclopenta［a］phenanthrene－15，16－dione）2个。这些化合物可作为白芍的质量标志物进行更深一步的研究。
图5 “白芍－成分－靶点－功能”网络
2.2 指纹图谱研究
2.2.1 色谱条件
色谱柱：Waters Xselect CSH C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；
流动相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），洗脱程序见表3；
流速：0.8 mL/min；
柱温：30 ℃；
检测波长：230 mm；
采集速率：1点/秒（PDA）；
进样体积：10 μL。
表3 梯度洗脱程序
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称定没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、β－1，2，3，4，6－五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、原儿茶酸、氧化芍药苷和苯甲酰氧化芍药苷适量，分别加甲醇溶解，制成每1 mL含80 μg的各对照品溶液。
2.2.3 参照物溶液的制备
精密称定芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，制成每1 mL含60 μg的参照物溶液。
2.2.4 供试品溶液的制备
取白芍中粉约0.1 g，精密称定，置于250 mL圆底烧瓶中，加入50%乙醇35 mL，加热至沸腾，保持微沸，回流2 h，冷却，将药液和药渣全部转移至50 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。
2.2.5 方法学考察
2.2.5.1 重复性
由分析人员1取白芍饮片，按“2.2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。以芍药苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD，结果各共有峰的相对保留时间RSD ≤ 0.08%，相对峰面积RSD ≤ 1.16%，表明该方法重复性良好。
2.2.5.2 中间精密度
由分析人员2取白芍饮片，按“2.2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。以芍药苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD，并与分析人员1测定的共有峰的相对保留时间和相对峰面积比较，结果各共有峰相对保留时间RSD ≤ 3.7%，相对峰面积RSD ≤ 8.0%，表明该方法中间精密度良好。
2.2.5.3 稳定性
由分析人员1取白芍饮片，按“2.2.4”项下方法制备1份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，供试品溶液分别于室温下放置0、9.5、35、112 h后进样测定。以芍药苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD，结果各共有峰相对保留时间RSD ≤0.6%，相对峰面积RSD ≤ 2.0%，表明白芍供试品溶液室温下112 h稳定。
通过HPLC建立的白芍指纹图谱，实现了10个色谱峰的基线分离，占总峰面积的99.999%。指认了其中7个色谱峰，分别为没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、β－1，2，3，4，6－五没食子酰葡萄糖、苯甲酸和苯甲酰芍药苷，该7种化合物的峰面积占指认峰面积的94.1%。见图6和表4。
图6 白芍指纹图谱
表4 指纹图谱中各峰的保留时间及峰面积
2.2.6 指纹图谱建立及相似度评价
取16批白芍按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，设置参照图谱，进行多点校正、Mark峰匹配，以平均数法生成对照图谱，采用自动匹配模糊模式计算相似度。16批白芍的相似度为0.950～0.995。见图7和表5。
图7 16批白芍指纹图谱相似度分析图谱
表5 白芍指纹图谱相似度
白芍是临床常用的中药之一，已有1 200多年的药用历史。《五十二病方》是现存最早的记载白芍入药的文献，《神农本草经》和《伤寒杂病论》中也都有白芍相关的详细记载［8］。目前，众多研究者运用多种手段，通过多种途径对白芍开展了系统深入的研究，并取得了一系列成果。依托于现代分析技术的指纹图谱，包括液相色谱法（HPLC、UPLC）、薄层色谱法（TLC）、电泳法（CE）以及光谱法（IR、UV）等［9］，目前共从白芍中分离出约170种化合物，包括70余种单萜及其苷类化合物，20余种三萜及其苷类化合物，20余种黄酮类化合物，30余种鞣质类化合物，9种多糖类化合物，还有20余种其他类化合物［10-12］。药理研究发现，白芍提取物能通过抑制炎症反应治疗干眼症［13］。王双等［14］对白芍水提物的抗炎作用进行了研究，发现其能降低血液和局部组织的血清前列腺素E2、一氧化氮和丙二醛含量。王思宇［12］分离纯化了3个白芍多糖并探究了其对自身免疫性肝炎的治疗作用，得到18个核心靶点，3条关键通路。白芍总苷是白芍有效成分的总称，有广泛的药理作用，不仅对自身免疫性疾病有治疗作用［15-17］，可减轻类风湿性关节炎、骨关节炎的滑膜细胞损伤［18-19］，缓解银屑病的临床症状［20］，对消化系统疾病也有较好的治疗作用［21］。
本研究通过TCMSP数据库得到白芍有效成分13个，通过PPI网络得到连接节点最多的2个靶基因，MAPK1和IL6。MAPK1是MAPK家族中的一员，参与调控细胞的有丝分裂、增殖、炎症、侵袭和转移等生理过程，在多种妇科疾病中都发挥着重要的作用［22-23］，与缺血性脑卒中也有一定关系［24］。MARIALETIZIA等［25］研究发现，MAPK1能够影响神经发育。而IL6是持续炎症的重要标志，能够参与综合免疫反应［26］。通过功能富集分析和通路富集分析发现，白芍主要通过影响转录因子活性和与酶、蛋白质的结合，作用于癌症通路、糖尿病并发症中的AGE－RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、乙肝通路、IL－17信号通路、TNF信号通路等。白芍归肝、脾经，肝主疏泄，脾主运化，肝脾不和则气血失调，百病则生。白芍通过参与免疫调节、氧化应激等作用于神经系统和内分泌系统，发挥养血调经、柔肝止痛的功效。
通过中药调控网络得到与白芍功效相关靶基因关联性较强的白芍活性成分有山柰酚、β－谷甾醇、儿茶素、芍药苷、谷甾醇、芍药苷元和（3S，5R，8R，9R，10S，14S）－3，17－二羟基－4，4，8，10，14－五甲基－2，3，5，6，7，9－六氢－1H－环戊烷［a］菲－15，16－二酮。研究表明，山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌等作用，在神经保护、护肝、护心等方面有广阔的应用前景［27］。儿茶素能够降低酒精性脂肪肝小鼠的AST、ALT水平，同时增加SOD活性，发挥一定的护肝功效［28］。β－谷甾醇能够通过血脑屏障，沉积于细胞膜上，在人体内有降脂、抗脱发、抗肿瘤等多种作用［29］。芍药苷具有广泛的药理作用，包括神经保护［30］和免疫调节［31］等。通过高效液相建立白芍的指纹图谱，将白芍中10种化合物基线分离，并指认了7种主要化合物，分别为没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、β－1，2，3，4，6－五没食子酰葡萄糖、苯甲酸和苯甲酰芍药苷。结合网络药理学与指纹图谱研究结果，将儿茶素和芍药苷作为白芍的质量标志物进行更深入的研究有一定的科学性。
综上所述，白芍的有效活性成分有山柰酚、β－谷甾醇、儿茶素和芍药苷，核心靶基因有MAPK1和IL6，通过病毒、免疫调节、脂质与动脉粥样硬化通路等作用于神经系统和内分泌系统，发挥养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的作用。通过指纹图谱，分离了白芍中10个化合物，并指认了7种，包括儿茶素与芍药苷等。儿茶素、芍药苷可作为白芍的质量标志物开展进一步研究。
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